藏红花之家——科学全面的藏红花行业网站 您好![请登陆] [免费注册]
首页 藏红花的食用 藏红花的功效 综合信息 藏红花美容 补血养生知识 藏红花图片 视频专区 交流平台
您的位置: 首页 - 文献资料:藏红花素诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及其作用机制

文献资料:藏红花素诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及其作用机制

出处:中华肿瘤防治杂志2009年10月第16卷第19期
作者:龚青、石丁波、蔡卫斌、杨中汉、谭维格、廖彩韵、彭超、刘畅、高国全、杨霞(中山大学中山医学院生物化学教研室 广东广州 510080)
目的:研究藏红花素对HeLa细胞的促凋亡作用和机制。
方法:设置0、0.2、0.4及0.8mmol/L 4个浓度梯度,MTT法分析不同浓度藏红花素对HeLa细胞增殖的影响;设置空白阴性对照及秋水仙素(10μg/L)阳性对照,向HeLa细胞培养物分别加入0.4和0.8mmol/L 的藏红花素,培养48h后用PI/Annexin V双染法分析其凋亡情况;1.6mmol/L 藏红花素作用于HeLa细胞72 h后,蛋白质印迹法检测Caspase-3的切割。结果:MTT实验分析显示,在0、0.2、0.4及0.8mmol/L 浓度下HeLa细胞存活率分别为1、0.964、0.796和0.586。藏红花素显著地抑制HeLa细胞生长,P<0.05;各浓度组间均差异有统计学意义,P<0.05。PI/Annexin V双染法、流式细胞仪检测显示,阴性对照组、10μg/L秋水仙素阳性对照组、0.4 及0.8mmol/L藏红花素处理组的细胞凋亡率分别为3.64%、15.99%、4.86%和9.28%,藏红花素促进HeLa细胞凋亡。蛋白质印迹法检测显示,藏红花素促进HeLa 细胞Caspase-3切割。
结论:藏红花素可明显地抑制HeLa细胞生长,并通过增加HeLa细胞Caspase-3切割促进其凋亡。

藏红花(Crocus sativas L.)是鸢尾科番红花属球根类草本植物,自古便是活血化瘀的良药。最新研究发现,藏红花还具有广谱抗癌活性,对白血病、卵巢癌、结肠癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤、乳头肉瘤、扁平细胞瘤和软组织肉瘤等都具有较强的抑制作用,而且毒性较小。藏红花素(crocin)是藏红花最主要的一种色素,对多种癌细胞均有明显抑制作用,且与其他常用抗癌药物配合使用,可降低这些药物的毒副反应,改善疗效。目前对于藏红花素抑癌机制的研究表明,其有多种可能的作用通路,其中细胞凋亡路径得到了较多的研究支持。本研究旨在对藏红花素促HeLa细胞凋亡的作用进行研究,并初步探讨其诱导细胞凋亡的机制。

1 材料与方法
1.1 药物与试剂
藏红花素和MTT购自美国Sigma公司,20mg藏红花素加12.5mg EDTA溶于4mL三蒸水,配成浓度为50mmol/L的母液,储存于4℃;RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit购自Bender Medsystens公司(凯基生物)。Caspase-3抗体购自Sant公司。

1.2 细胞系
HeLa细胞株可连续传代,将细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,长满后0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.3 主要仪器
包括超净工作台、二氧化碳培养箱和HITACHI分光光度仪。

1.4 MTT法
取对数生长期的HeLa细胞,进行细胞计数,用细胞培养液调整细胞密度为2×104 个/mL 接种到12孔平板,每孔为2 mL,将平板置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养,细胞贴壁后,吸出上清,加入含藏红花素的无血清培养液2mL,使得HeLa细胞藏红花素的浓度为0、0.2、0.4和0.8mmol/L,待检样品继续培养48 h。在实验终止前4 h加MTT(5 g/L)200μL/孔,继续孵育4h,吸出上清液,每孔加入1mL DMSO,摇匀,待Formazan溶解后,分光光度计在570nm处测OD值。实验中每份样品设3个复孔。用各个浓度的OD吸收值平均值除以对照组的OD吸收值,得出细胞存活曲线。

1.5 PI/Annexin V双染法
将对数生长期的细胞用含有10% 胎牛血清的RPMI1640培养液重悬,调整细胞浓度加入6孔培养板中继续培养,当细胞达到60%~70%融合时加入以无血清培养液配制的浓度为0.4和0.8mm/L 的藏红花素,阴性对照组为等量无血清培养液,阳性对照组为秋水仙素(10μg/L)。培养箱中继续培养48h后,0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液,进行PI/Annexin V双染,流式细胞仪测定凋亡指数,进而分析确定藏红花素对HeLa细胞的凋亡作用。

1.6 蛋白质印迹法
SDS细胞裂解液收集药物处理24h的HeLa细胞,冰上超声1min,煮沸10min,10000r/min(r=10.3cm)离心15min,取上清液,行蛋白定量分析,然后进行SDS-PAGE电泳,再将其转移到PVDF膜上,脱脂牛奶封闭1h,加入1:1000 稀释的兔抗人切割Caspase-3抗体,4℃孵育过夜,再加入1:1000稀释的羊抗兔IgG 抗体,室温孵育2h,ECL显色,曝光。

1.7 统计学方法
所有数据用x±s表示,通过SPSS11.0 软件完成。采用方差分析,并用最小有意义差异狋检验(Least significant difference-t,LSD-t)进行均数间的多重比较,检验水准α=0.05。

2 结果
2.1 藏红花素对HeLa细胞增殖的抑制作用
在0.4 mmol/L 的浓度下,藏红花素处理组与对照组细胞相比呈现下降趋势(P<0.05),且其抑制作用表现为浓度依赖性(图1)。各组HeLa细胞生存率间差异有统计学意义,P<0.05。

<a href=http://www.zanghonghua.cc>藏红花</a>素对HeLa细胞生存率的影响
图1 藏红花素对HeLa细胞生存率的影响 ※vs空白对照组,P<0.05;※※vs空白对照组,P<0.01

2.2 藏红花素对HeLa细胞凋亡的诱导作用
藏红花素处理过的HeLa细胞收缩,细胞质减少,胞质出现空泡状区域,并出现核固缩(图2)。流式细胞仪检测证实,藏红花具有诱导HeLa细胞凋亡的作用(图3)。阴性对照组凋亡率为3.64%,10μg/L秋水仙素阳性对照组为15.99%,0.4mmol/L 藏红花素处理组为4.86%,0.8 mmol/L 藏红花素处理组为9.28%。结果表明,藏红花素具有诱导HeLa细胞凋亡的作用。

2.3 藏红花素对HeLa细胞Caspase-3激活的促进作用
0.4、0.8mmol/L 藏红花素作用HeLa细胞24h后,蛋白质印迹法检测Caspase-3切割条带的变化,藏红花素能促进HeLa 细胞Caspase-3 蛋白的切割(图4)。提示藏红花素诱导HeLa 细胞凋亡过程中Caspase-3被激活。
<a href=http://www.zanghonghua.cc>藏红花</a>素诱导HeLa细胞凋亡
图2 藏红花素诱导HeLa细胞凋亡(×400) A:正常HeLa细胞;B:藏红花素处理的HeLa细胞;C:秋水仙素处理的HeLa细胞

<a href=http://www.zanghonghua.cc>藏红花</a>素诱导HeLa细胞凋亡
图3 藏红花素诱导HeLa细胞凋亡 1:空白对照;2:0.4mmol/L藏红花素处理组;3:0.8mmol/L 藏红花素处理组;4:10μg/L秋水仙素阳性对照组

<a href=http://www.zanghonghua.cc>藏红花</a>素对HeLa细胞Caspase-3的激活作用
图4 藏红花素对HeLa细胞Caspase-3的激活作用 1:对照;2:0.4mmol/L藏红花素作用HeLa细胞24h后,Caspase-3切割条带的变化;3:0.8mmol/L 藏红花素作用HeLa 细胞24 h后,Caspase-3切割条带的变化

3 讨论
藏红花广泛分布于伊朗、西班牙、法国以及希腊等地,印度、日本也有栽培,经印度传入我国西藏,因此称为藏红花。近年来,传统中药的多靶点作用机制、较少不良反应等优点表现出诱人的应用前景,筛选出高效低毒的抗肿瘤中药是研究热点之一。
藏红花的有效成分主要包括产生苦味的物质以及多种色素,而后者对藏红花的疗效有着更为重要的意义。藏红花素是藏红花最主要的一种色素,由藏红花酸(crocetin)糖基化形成,是极其少见的水溶性类胡萝卜素。其特殊的水溶性及其对癌细胞强有力的抑制作用,使其成为了藏红花色素中更有望应用于癌症治疗的成分。用藏红花素处理过的HeLa细胞收缩,细胞质减少,胞质出现空泡状区域,并出现核固缩,这些都是藏红花素引起HeLa细胞凋亡的形态学证据,与文献报道相符。本研究通过MTT法和PI/Annexin双染法等方法证实了这一凋亡作用的存在。然而藏红花素诱导HeLa细胞凋亡的信号通路尚不明确。
研究证实,藏红花素对多种癌细胞均有明显抑制作用,且在与其他常用抗癌药物配合治疗过程中,可降低抗癌药顺铂等的毒副反应,改善疗效。目前对于藏红花素抑癌机制的研究表明,其有多种可能的作用通路,其中细胞凋亡路径得到了较多的研究支持。我们对藏红花素促HeLa细胞凋亡的作用进行了研究,并初步探讨其诱导细胞凋亡的机制。
Caspase-3是CPP32亚家族成员之一,是新近予以关注的Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一,它被合成后通常以非活化的酶原形式存在于细胞质中,在多种凋亡信号刺激下经蛋白水解作用被激活成活化形式,可对多种蛋白底物进行降解,从而在细胞凋亡过程中起关键作用,被认为是整个凋亡级联反应的一个关键调节点。本研究证实,藏红花素能促进HeLa细胞Caspase-3蛋白的切割,提示藏红花素诱导HeLa细胞凋亡过程中Caspase-3被激活。
本研究对藏红花素诱导HeLa细胞凋亡的机制进行了初步研究,该途径上游通路还有待进一步研究。

据英国媒体9月12日报道,英国布莱福德大学的研究人员从藏红花中提取出一种能有效杀死癌细胞的成分,这种物质不仅能抑制癌细胞的生长,长时间用药还能杀死癌细胞。经过实...[阅读全文]

藏红花泡水过程图解  查看大图>>
CopyRight © 2002-2011 藏红花之家 www.zanghonghua.cc All Rights Reserved  苏ICP备08013062号